·述评·
我国大陆人群 HLA新等位基因发现的现状及应注意的问题
孙玉英 奚永志
Discovery of novel HLA alleles among populations in mainland China：current status and problems to solve
作者单位： 100071，北京，军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫实验室
通讯作者：奚永志， Email: xiyz@yahoo.com
人类对白细胞抗原（ human leucocyte antigen，HLA）系统的发现、认识与应用已近半个世纪，正是由于对该系统的不断深入揭示，已极大地推动和改观了基础免疫学、器官移植、骨髓库\脐血库人类遗传学、法医学、肿瘤免疫学、肿瘤疫苗学、自身免疫疾病和传染性疾病遗传易感性等诸多学科的落后局面 [1] 。由于 HLA的 高度复杂性、多态性（ polymorphism）、多样性（diversity） 等遗传特点， 截止到 2006年7月，国际上已先后发现了2533个编码HLA的等位基因，但绝大多数HLA等位基因则是由欧美等国的科学家发现命名的，而由中国大陆科学家发现的等位基因数量微乎其微。虽然我国大陆开展HLA的研究工作已近30年，而由中国人自己发现HLA新等位基因的历史却较短暂。截止到2006年6月，中国大陆共发现了43个有籍可查的HLA新等位基因。可以相信，随着我国骨髓库和脐血库的相继建立与完善，无关供体（志愿者）数量的不断增加以及HLA配型技术的标准化，具有中国人群特异性的HLA新等位基因发现的数量必将进一步增加。况且，目前有关HLA新等位基因的发现工作在我国呈现出一种蓄势待发争先恐后的态势，国内相关媒体和机构也都给予了极大的关注。对此，我们应针对HLA新等位基因的发现与现状给予冷静的回顾与理性的思考。
一、我国 HLA新等位基因发现的现状
1994年，上海免疫研究所范丽安教授与美国科研机构合作首次报道了中国大陆发现HLA-DRB1 *1504新等位基因 ［2］ 。而真正由我国科学家自主发现H2A新等位基因的工作则在2002年以后，2002年深圳市输血医学研究所在中国大陆人群中检测出3个HLA新等位基因 ［3-5］ 。此后，四川省输血研究所、上海市血液中心、浙江省血液中心、军事医学科学院附属医院、北京市血液中心、北京大学医学院、江苏省人民医院HLA实验室、辽宁省血液中心、广东省 , 山东省和陕西省相继发现了HLA新等位基因。从HLA新基因发现的单位来看，大多数为各省市的血液中心及国内知名的HLA研究室，因为他们有足够的标本量和科研实力来从事HLA新等位基因的发现工作。而对于病例数较少，科研实力相对较弱的研究单位来讲，发现HLA新等位基因的可能性就会很小。
二、HLA新等位基因的检测技术
从 HLA新等位基因发现的过程和方法来看，大多为通过常规的HLA分型技术对无关造血干细胞移植供体（志愿者 ） 或移植供受体进行 HLA 分型时出现了难以判定的结果 ， 最后通过基因测序分析发现了新的 HLA 等位基因。由此可见，目前所采用的常规 HLA分型技术仅能对已知的HLA等位基因进行指定，而对未知的新等位基因则无能为力 [6，7] 。HLA基因的直接测序分析，有时会因所选基因片段的大小或位置而影响到新等位基因的发现，同时直接测序分析也会造成模棱两可的结果出现。实验证明，只有经过克隆、测序分析才能真正地将单个HLA等位基因分开，此方法的缺点是费时较长，而且较为繁琐。目前，国内所采用的HLA克隆测序有两种形式，一种为基因组的克隆测序，另一种则为全长cDNA的克隆测序，两种方法均可以明确判定新等位基因的存在与否。HLA某一位点基因组测序的优点是可以发现内含子及外显子中的各种碱基突变，其缺点是不能发现HLA等位基因的不同剪接转录本，而不同剪接转录本形式对于HLA新等位基因功能的阐明是至关重要的。通过HLA某一位点全长cDNA的克隆测序则可以克服上述缺陷，从实际的科学意义来讲，采用HLA某一位点全长cDNA测序才能真正揭示每个新发现基因的生物学特性及其生物学意义。目前，WHO-HLA因子命名委员会对内含子序列发生改变的HLA等位基因也进行命名，这主要是由于某些内含子序列的改变可能导致不同转录剪接点的产生，从而形成不同的HLA多态性。因此，在HLA新等位基因的发现过程中，建议最好同时进行HLA某一位点基因组和全长cDNA序列的测定，以利于更好地阐释HLA新等位基因的分子特性。
三、HLA基因多态性形成的机制
HLA复合体是人体最复杂和最具多态性的遗传系统，其多态性形成的机制主要是碱基突变、链间转换以及基因重组。从目前我国发现的43例HLA新等位基因的形成机制来看均属于碱基突变。有一些碱基突变造成了氨基酸残基的改变，其中位于HLA-I类分子 α1及 α2区及HLA-Ⅱ类分子（如HLA-DR分子） β 1氨基酸的改变有可能造抗原肽结合能力和/或TCR识别作用的改变，从而能够识别不同抗原分子，引起不同的免疫应答反应。而位于其他功能区的氨基酸改变对HLA分子的抗原识别及T细胞受体相互作用的影响就较小。另外一些氨基酸突变发生在三联密码的第3位，往往造成同义突变，也就是氨基酸没有发生变化，从而HLA分子的结构与功能也将不发生改变。基因重组造成的HLA多态性可有两种形式：(1)假如重组点发生在HLA等位基因上，那么不仅可以产生新的HLA等位基因，而且可形成新的单倍型（位于同一条染色单体上的HLA基因型别）；(2)假如重组点出现在非等位基因区，那么将只形成新的单倍型，而不形成新的等位基因。在仅有一两个位点不相合的同源染色体之间则很难区分HLA基因多态性是由于链间基因转换还是基因重组造成的 [8] 。目前，关于HLA多态性形成机制的分子基础尚不十分清楚，所以，对于HLA重组家系的研究就显得格外重要 [9] 。
四、HLA新等位基因发现的基础与临床意义
HLA 复合体编码的抗原参与机体的免疫应答、免疫反应和免疫调节，并决定组织相容性，是人体启动一系列免疫应答与免疫反应的门户与枢纽。 HLA 新等位基因的出现增加了 HLA 系统多态性，因此就有可能成为防止新的致病微生物对人体侵害的防御屏障，所以， HLA 新等位基因的出现是自然选择的结果，对于人类继续繁衍生息具有重要的意义。此外，由于 HLA 等位基因就如同人的指纹一样具有个体特异性，并以单倍体紧密连锁的方式遗传给下一代，因此 HLA 新等位基因的发现对法医学鉴定以及人类迁移和人类遗传学研究等方面同样具有重要意义。
值得注意的是，器官及造血干细胞移植前供受体 HLA配型对于临床移植的成败至关重要，而HLA新等位基因的不断发现对临床移植提出了更高的要求。毋容置疑，器官移植与造血干细胞移植已经成为迄今为止医治各种器官功能衰竭、脏器恶性肿瘤和多种恶性血液病等顽症的行之有效的重要措施之一。由于供-受者间组织相容性抗原差异的主要作用，当然还有其他诸多已知与未知因素如次要组织相容性抗原（mH）、组织特异性抗原等等影响，不可避免的要发生宿主抗移植物（HVGD）和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，这是导致同种异体组织器官移植失败的最根本、最重要的原因之一！因此，HVGD和GVHD已成为临床上同种异体组织器官移植领域面临的最大障碍！业已证实，组织器官移植后，移植物能否存活很大程度上取决于供-受体之间HLA型别是否相符。在肾脏移植中，各HLA座位的重要性依次为HLA-DRB1、HLA-B、HLA-A。在造血干细胞移植中，HLA的匹配程度与GVHR发生的密切程度更大，一般状况下必须选择HLA完全相同的个体作为供者。然而在进行异基因脏器移植时， 首先遇到的最大障碍就是难以寻找到一个白细胞抗原（ HLA）完全相匹配的适宜供体，这已成为迄今为止似乎难以逾越和远未得以圆满解决的一个关 键性问题！ 因此，移植前进行精细的 HLA 分型对于防止移植排斥反应、延长患者生命和提高移植成功率具有重要意义。应特别指出的是，随着我国无血缘关系供受体移植病例的迅猛增加，发现中国人群中的 HLA 新等位基因，以提高 HLA 配型的精确度就显得格外重要。
五、我们应思考的几个问题
我们应清醒地认识到，单就 HLA 新等位基因的发现来讲，其发现是历史的必然。随着我国各骨髓库和脐血库的相继成立， HLA 配型技术的规范化和无血缘关系志愿供体数量的扩大，在中国人群中再发现 HLA 新等位基因已是顺理成章无需惊异的事。 HLA 新等位基因的发现同时也说明了我国在这一研究领域的崛起和长足进步。但是令人遗憾的是，到目前为止我国大陆仅发现了寥寥 43 个 HLA 新等位基因，这与我国十数亿之众和 56 个民族的人群分布特点严重不符，这可能是目前检测的样本量还不够大，也可能是我国大陆人群中常见的 HLA 等位基因型别已包含在目前国际已发现的常见 HLA 型别之中。我们还应清醒的认识到，在我国大陆已发现的 43 个新等位基因中，几乎所有的基因频率均低于 0.0002 。所以，这些等位基因无论是在 HLA 免疫遗传学、移植免疫学、人类学以及法医学等的功能研究方面到底能占到多大的作用，还值得我们进一步深思和探讨。国内工作者在报道新等位基因数据时，普遍存在技术支持不充分的问题，因此尽管国际 HLA 数据库给予报道，但能被 HLA 词典选入的较少，这大部分原因是技术资料不足所造成，例如只做 HLA 基因直接测序，没有作克隆测序，缺乏建立携带新等位基因的细胞株，缺乏相关血清学特异性的研究，缺乏家系调查等等，如果只是报道新等位基因的 DNA 序列结构的突变点，得到基因库数据注册号和新等位基因的命名，其数据可信度将是不充分的。最后，国内对于新发现的这 43 个 HLA 等位基因均未进行深入系统的生物学功能研究，尤其是对其转录和翻译过程大都未进行任何深入的探究，这势必极有可能漏掉一些科学的真相，从而滞后这一研究领域的发展。应切记，单独发现某一等位基因的存在并不是我们真正的目的，人类基因的发现和研究最关键最重要的是要体现在其功能意义上，否则就失去了它应有的基础科学和临床应用价值。
参考文献
1 奚永志 . 我国骨髓库 / 脐血库 HLA 分型应注意的几个问题 . 中华医学杂志 ,2003,83:443-445.
2 Fan LA , Smith AG , Chandanayingyong D ，et al. DRB1*1504 (DR2Dai): a new DR2 allele identified in the Dai minority population of southwest China . Tissue Antigens ，1994，44:326-328.
3 Wu GG , Cheng LH , Deng ZH , et al. Cloning and complete sequence of a novel HLA-A null allele, A*0253 N, with a termination codon generated by a C to G mutation in exon 2. Tissue Antigens ， 2002 ， 59:328-330.
4 Wu GG, Cheng LH, Zhou D, et al.Identification of a novel allele HLA-B*5610 in a Chinese potential bone marrow donor.Tissue Antigens, 2003, 61:256-258.
5 Wu GG, Cheng LH, Li Z, et al.Identification of a new HLA allele, A*1114, in a Chinese family.Tissue Antigens, 2003, 61:253-255.
6 刘金锋 , 孙玉英 , 奚永志 . 造血干细胞移植配型中 HLA 分型方法的研究进展 . 中华血液学杂志 , 2005 ， 25 ： 441-443.
7 刘曙光 , 孙玉英 , 奚永志 . 焦磷酸测序 -HLA 基因高分辨分型的新策略 . 中华器官移植杂志 , 2005 ， 26 ： 574-576.
8 Perasaari JP , Koskela S , Partanen J .Characterization a novel HLA-B40 allele with serological Bw4 motif, HLA-B*4047, in the Finnish population and confirmation of B*270503 allele. Tissue Antigens, 2004, 63:595-597.
9 骆媛 ,孙玉英,奚永志. 人类白细胞抗原分子遗传中的基因重组.中华遗传学杂志, 2005，22:427-430.
(收稿日期：2005-12-14)
(本文编辑：苗蔚)